Эксперимент
Приезжаю утром в лабораторию в ИТЭБ РАН. Там все готово для эксперимента. Слайды с препаратом помещены в щелочной раствор, таймер отсчитывает минуты. Сегодня ученые будут наблюдать поврежденные клетки асцитной карциномы Эрлиха. Это рак, который развивается в жидкости, заполняющей брюшную полость мышей. Накануне эксперимента клетки откачали шприцем прямо из животных, зафиксировали в агарозном геле, затем образцы облучили в рентгеновском аппарате дозой 8 Грей, смоделировав сильное внешнее воздействие. Рентгеновские лучи порождают множество активных форм кислорода, которые буквально режут ДНК. Потом образцы погрузили в лизирующий раствор, чтобы разрушить мембраны клетки, ядра и освободить ДНК.
Пищит таймер, техник Татьяна Михайловская промывает слайды и помещает в электрофоретическую камеру. Под действием электрического тока разорванные петли ДНК вытягиваются, поэтому при увеличении клетки выглядят как кометы. Круглая голова — это неповрежденная часть ДНК, а хвост — то, что от нее оторвалось. Чтобы увидеть всю эту красоту, клетки красят флуоресцентным красителем.
— Сейчас мы отрабатываем методику, чтобы применить ее на инвертированном флуоресцентном микроскопе в Центре коллективного пользования, — рассказывает старший научный сотрудник, руководитель работ Николай Сирота. Он первым в России стал использовать метод ДНК-комет, внес в него много нового, заложил основы для внедрения метода в широкую практику.
Пока идет электрофорез, заведующая лабораторией, кандидат биологических наук Елена Кузнецова объясняет, что именно показывают ДНК-кометы:
— Некоторое количество разрывов ДНК в клетках происходит постоянно. Но у клеток очень мощная система восстановления ДНК, которая с возрастом не утрачивает эффективности. Базовый уровень повреждений в клетке составляет около 4%.
Она показывает на график, где изображен уровень поврежденных ДНК в лейкоцитах крови 21 здорового человека. Ровность графика нарушает пик — так выглядит резкий рост повреждений у одного из доноров. Это свидетельствует о том, что человек подвергается какому-то вредному воздействию или болеет.
— В литературе есть данные о том, что при ожирении уровень повреждения ДНК повышен, потому что ткани сдавливаются, нарушается кислородный баланс, при ишемии, гипертонии, некоторых видах онкологии, у курильщиков, работников вредных производств, — говорит Елена Ананьевна.
Снова звучит таймер. Все, эксперимент завершен. Николай Петрович садится за микроскоп, кладет слайд, выравнивает его по координатам и сравнивает с фотографией того же слайда, сделанной вчера, до того как образец покрасили и подвергли электрофорезу. Не сразу, но удается совместить поля зрения двух изображений. Фотография клеток на слайде до процедур должна совпадать с фотографией клеток после процедур. Это нужно, чтобы исключить технические ошибки в процессе эксперимента.
Заглядываю в микроскоп и я. На черном фоне ярко алеют четыре «кометы» — это поврежденные ДНК. А вот на фотографии слайда до окрашивания видны три клеточных ядра. Куда же пропала одна клетка?
— Есть такой парадокс в радиотерапии. Какой бы дозой ни облучали, всегда найдутся раковые клетки, которые выживут. Они потом делятся, и опухоль может снова вырасти, — говорит Николай Петрович.
Клетка, которую я не вижу, не поддалась облучению. Ее мембрана осталась цела, и потому краситель в нее не проник. Мембрана разрушилась только при лизировании, и ДНК клетки высветил флуоресцентный краситель.
Когда методика будет отработана, ученые приступят к решению главной задачи — изучить, как доксорубицин, один из самых сильных препаратов для химиотерапии, воздействует на ДНК через несколько суток после введения. Доксорубицин вводят больному в неактивной форме. В первые часы он проникает в клетку, трансформируется там и способствует выработке большого количества активных форм кислорода, которые убивают все вокруг. Гибнут и раковые, и здоровые клетки. А что происходит потом, никто толком не знает. Есть данные, что доксорубицин накапливается в клетках и участвует в сшивании цепей ДНК. Последние работы показали, что препарат накапливается в ДНК митохондрий — особых органеллах клетки, которые вырабатывают энергию. После повреждений, причиненных химиотерапией, клетки начинают восстанавливаться и требуют большого количества энергии. Если митохондрии работают нормально, то и восстановление идет. Но как влияет доксорубицин на митохондрии? Он их угнетает или, наоборот, стимулирует? Это и намерены выяснить ученые. Их конечная цель — понять, как разные пациенты реагируют на доксорубицин, нащупать индивидуальные различия, чтобы помочь врачам более тонко настраивать схему химиотерапии.
— Когда отработаем метод на клетках животных, перейдем к исследованиям с клетками пациентов, — делится планами ученый. — Одновременно мы будем следить за результатами эксперимента методами молекулярной биологии, с помощью ПЦР в реальном времени. Тогда у нас будет комплексная картина, понимание, что происходит в одной клетке при повреждении. Это долгосрочная задача, которую мы, может, и не решим при жизни. Продолжит следующее поколение.
Кто изобрел ДНК-кометы
В 1984 году шведские ученые поместили клетки в специальный гель, который застывал при 20 градусах. Таким образом, клетки сохранялись живыми, и далее можно было определять, насколько повреждена в них ДНК — носитель генетической информации. Метод назвали «Comet assay», буквально «кометный анализ», из-за формы клеток с поврежденной ДНК, которую наблюдают во флуоресцентном микроскопе.
После чернобыльской аварии Николай Сирота с коллегами участвовал в исследованиях образцов крови людей, проживавших в зоне поражения. Ученых интересовало, насколько повреждена ДНК у людей. Методы в то время были очень дорогостоящие и долгие в обработке. Усовершенствованный метод ДНК-комет, который позволял определять повреждения ДНК, вызванные радиационным излучением, появился позже, в конце 80-х. Для анализа достаточно просто взять кровь из пальца. Благодаря этому метод стал популярен и быстро распространился в научном мире. Начали осваивать его и в Пущино.
Сначала ДНК-кометы снимали под микроскопом на обычный фотоаппарат, длину хвоста измеряли линейкой, затем данные обрабатывали вручную. Несмотря на трудности, в 1991 году Николай Сирота с соавторами опубликовал первую в России статью с результатами исследований, выполненных этим методом.
Затем последовал период стагнации науки, и вернуться к методу ДНК-комет удалось только в 2000-м. Вместе с коллегами из Института биофизики клетки Николай Сирота участвовал в исследованиях, поддержанных грантом НАТО, который позволил разработать программное обеспечение для обработки изображений и существенно развить метод. Ученые изобрели особые подложки для работы сразу с несколькими слайдами, что увеличивало производительность метода.
— Чем интересен этот метод? Он позволяет узнать, как действуют искусственные вещества на ДНК человека, не будут ли они вызывать заболевания, — поясняет Николай Петрович.
Сейчас каждое новое вещество, будь то краситель, лекарство, материал и т.д., обязательно тестируют на генотоксичность, то есть степень повреждающего воздействия на ДНК. Самый распространенный микроядерный тест уступает методу ДНК-комет по скорости и экономичности. Но метод ДНК-комет еще не стандартизован, поэтому сложно сравнивать результаты исследований, полученные в разных лабораториях. К тому же, не проанализированы накопленные за годы исследований этим методом данные.
Каждые два года ученые из всего мира, которые развивают метод ДНК-комет, собираются на конференцию. Регулярно в них участвует и Николай Сирота. В этом году конференция проходила в Испании. По ее итогам международный оргкомитет принял решение провести следующую конференцию в 2019 году в России, в ИТЭБ РАН. Работа по подготовке конференции уже началась. Оргкомитету предстоит составить программу, найти гранты на поддержку российских ученых и молодежи, ведь для многих такие поездки и оргвзносы не по карману. На конференцию ожидают около двух сотен участников из-за рубежа и со всей страны. Ведь метод ДНК-комет активно используют в России — в Москве, Ростове-на-Дону, Саратове, Воронеже, Сыктывкаре, на Дальнем Востоке.
От рака к кофе
Метод ДНК-комет востребован в научных кругах для тестирования новых и уже существующих лекарственных препаратов. Несколько лет назад Николай Сирота участвовал в исследованиях врачей из Ростовского Института онкологии, которых интересовало, как доксорубицин действует на организм через несколько дней после его введения. Ученые тестировали образцы крови 17 пациенток в ходе трех курсов химиотерапии, через 21 день каждый, и обнаружили, что только у четырех из них заметен повреждающий эффект ДНК, у остальных его уже нет — клетки восстановились, хотя препарат по-прежнему обнаруживался в крови.
— Это неожиданный результат. Мы просим врачей проследить за состоянием этих четырех женщин и дальше; выяснить, какие последствия химиотерапии у них обнаружатся, — говорит ученый.
Поскольку метод новый, то статистики по людям, чью кровь изучали, не накоплено. Работу в этом направлении только начало международное научное сообщество. Ученые решили собрать воедино данные по пациентам, которые участвовали в обследовании этим методом. В проекте задействованы ИТЭБ и несколько российских лабораторий. Данные о том, какое лечение получал человек, что и как прошло, как менялось его состояние, какие наблюдались осложнения, помогут понять, каковы же отдаленные последствия тех или иных воздействий, вызывающих повреждение ДНК.
Отдельно стоит вопрос о том, что происходит с ДНК при хронических повреждающих воздействиях. Взять, к примеру, кофе. Многие пьют по нескольку чашек в течение дня, что можно рассматривать как хроническое воздействие. Ученые из Швеции сейчас как раз выясняют этот вопрос. В их эксперименте участвуют 160 добровольцев, которые бесплатно пьют кофе, соки и еще получают за это гонорар. Так что скоро мы узнаем, полезен кофе или вреден.
